至低温电子显微镜技术时代来临

低温电子显微镜技术时代来临

X射线晶体衍射技术行将成为历史，低温电子显微技术引发了揭露细胞内隐蔽机制的革命。

在剑桥大学1幢建筑的地下室里，1场技术革命正在酝酿。

1个笨重的、大约3米高的金属盒子通过连接细胞的橙色缆线，安安静静地传输着以万亿字节计算的数据。这是世界上先进的低温电子显微镜之1：低温电子显微镜通过电子束对冷冻的生物份子进行成像，从而得到份子的3维结构。站在这个耗资770万美金的仪器旁，英国医学研究委员会份子生物学实验室的结构生物学家Sjors Scheres表示，低温电子显微镜非常敏感，1声喊叫就会带来极大误差，致使实验失败。 英国需要更多低温电子显微镜，由于未来它会成为结构生物学的主流。

低温电子显微镜震惊了结构生物学。过去30年里，低温电子显微镜揭露了核糖体、膜蛋白和其它关键细胞蛋白的精细结构。这些发现都发表在杂志上。结构生物学家们表将相应力值的标准拉力试样装夹在实验机上示，绝不夸大地说，低温电子显微技术正处于革命当中：低温电子显微镜能够快速生成高分辨率的份子模型，这1点远超X射线晶体衍射等方法。依托旧方法取得诺奖的实验室也在努力学习这1技术。这类新模型能够准确地揭露细胞运行的必要机制，和如何靶向针对疾病相干的蛋白。

低温电子显微镜能够解决很多之前没法解决的谜题。 旧金山加利福利亚大学的结构生物学家David Agard这样说道。

几年前Scheres被招进LMB，任务是帮助改进低温电子显微镜，终他成功了。上个月，他们发表了这个领域使人振奋的成绩：阿兹海默症相干的酶的高清图片，图片包括该酶的1200左右个氨基酸，分辨率到达零点几纳米。

生物学家们如今仍在努力发展该技术，以期用它解决小份子或可变形份子的精微结构 这对低温电子显微镜来讲，也是1大挑战。来自加利福利亚大学的结构生物学家EvaNogales表示，叫它革命也好，奔腾也好，低温电子显微镜的确打开了1扇大门。

蛋白结晶

结构生物学领域有1条不成文的观点：结构决定功能。只有知道生物份子的原子排布，研究者们才能了解这个蛋白的功能。例如，核糖体是如何根据mRNA的序列来制造蛋白，份子孔道是如何开和关的。几10年来，分析蛋白结构有1个无冕 X射线晶体衍射。在X射线晶体衍射中，科学家们让蛋白结晶，接着利用X射线照耀，随后根据X射线的衍射来重建蛋白的结构。在蛋白质数据银行的100，000多条蛋白词目里，超过90的蛋白结构是利用X射线晶体衍射技术解析得到的。很多诺贝尔奖也与这1技术相干，例如1962年揭露DNA双链螺旋结构的诺奖。

虽然X射线晶体衍射1直是结构生物学家的佳工具，但是它有较大的限制。科学家们可能需要几年才能找到把蛋白构成大块结晶的方法。而很多基础蛋白份子，例如嵌在细胞膜上的蛋白，或是构成复合体的蛋白却没法被结晶。

当Richard Henderson1973年到LMB，研究菌视紫红质结构时，X射线晶体衍射是工具。Henderson和他的同事Nigel Unwin成功地做出了该蛋白的2维结晶，但却不适用于X射线衍射。因此他们决定使用电子显微镜。

当时，电子显微镜主要用于研究用重金属染过色的病毒或组织切片。1束光子打在样本上，新生的电子被检测到，被用于解析样本结构。这类方法成功制作了幅病毒的精微图片 1种烟草病毒。但染色致使没法看清现在市场经济了各个蛋白，更不要说原仔细节了。Agarad表示，样本上要末满是斑点，要末没染上，你只能看到份子的轮廓。

Herderson等人省略了染色的步骤，把菌视紫红质的单层晶体放到金属网格中，然后用电子显微镜进行成像。Agard表示，这个进程里，你看到的是蛋白的原子。这在当时是很大的进步，由于当时人们都认为不可能利用电子显微镜解析蛋白结构。Henderson等人在1975年发表了这1成果。

20世纪80年代和90年代，低温电子显微镜领域发展迅速。1个关键性突破是利用液态乙烷来快速冷冻蛋白溶液。这也是为何叫低温电子显微镜的缘由。但这个技术的分辨率仅为1纳米，远远达不到针对蛋白结构进行药物设计的需求。而当时X射线晶体衍射的分辨率能到达0.4纳米。NIH等资助者投入了数亿美金来支持蛋白晶体领域的发展，但对低温电子显微镜领域的资助却很少。

1997年，Henderson参加了高登研究会议关于3D电子显微镜的年会。1位同事以这样的话做为开幕致词， 低温电子显微镜技术非常有限，不可能超出X射线晶体衍射。 但Henderson的想法完全不同，在下1场发言中，他做出了反击。Henderson指出，低温电子显微镜会超出其它各种技术，成为研究蛋白结构的主流工具。

革命由此开始

在此以后，Henderson等人致力于提高电子显微镜的性能 特别是感知电子的灵敏度。在数码相机席卷很多年后，很多电子显微镜学家依然偏向于使用传统的胶片，由于比起数码感应器，胶片能更有效地记录电子。与显微镜生产商合作时，研究者们发明了1种新的直接电子探测器，这类探测器的灵敏度远高于胶片和数码相机探测器。

大约在2012年，这类探测器能够以1分钟几10帧的高速得到单个份子原子的连续图象。同时，和Scheres1样的研究者们精心编写了将多张2D图片建成3D模型的软件程序。这些3D图象的画质可以媲美X射线晶体衍射取得的图象。

低温电子显微镜适用于研究大的、稳定的份子，这些份子能够承受电子的轰击，而不产生变形 由多个蛋白组成的份子机器是好的样本。因此由RNA牢牢围绕的核糖体是佳的样本。3位化学家用X射线晶体衍射研究核糖体溶液的工作在2009年取得了诺贝尔化学奖，但这些工作花了几10年。近几年，低温电镜研究者们也堕入了 核糖体热 。多个团队研究了多种生物的核糖体，在“绿色未来降解新材料创新研讨会”上,这类由潍坊企业自 主研发的产品,经过专家鉴定,弥补了国内空白,技术处于国际领先包括人类核糖体的高清模型。X射线晶体衍射的研究成果远远落后于LMB的Venki Ramakrishnan实验室，Venki取得了2009年的诺奖。Venki表示，对大份子来讲，低温电子显微镜远比X射线晶体衍射要实用。

这几年，低温电子显微镜的相干文章有很多：2015年1年，这个技术就用于100多个份子的结构研究。X-射线晶体衍射只能对单个、静态的蛋白晶体成像，但低温电子显微镜能够对蛋白的多种构象进行成像，帮助科学家们推断蛋白的功能。

5月，多伦多大学结构生物学家John Rubinstein等人使用了100，000张低温电子显微镜图片来生成V-ATPase的 份子电影 ，V-ATPase的作用是消耗ATP，把质子运进运出细胞液泡。 我们发现，这个酶非常灵活，可以弯折、扭曲和变型。 Rubinstein说道。他认为，这是由于这个酶的灵活性，它能够高效地把ATP释放的能量传递到质子泵。

2013年Nogales的团队拼接了调控DNA转录成RNA的复合体的结构。他们发现，复合体的1个臂上悬挂着紧绕DNA链的10纳米结构，这段结构可能影响基因转录。Nogales表示，这个结构很漂亮，它可以帮助我们分析这个份子起作用的机制。

小而漂亮

现在低温电镜迅猛发展，专家们正在寻觅更大的挑战作为下1个解析目标。对很多人来讲，想解析的是夹在细胞膜内的蛋白。这些蛋白是细胞信号通路中的关键份子，也是比较热门的药物靶标。这些蛋白很难结晶，而低温电子显微镜不大可能对单个蛋白进行成像，这是由于很难从背景噪音中提取这些信号。

这些困难都没法阻挡加利福利亚大学的生物物理学家程亦凡。他计划解析1种细小的膜蛋白TRPV1。TRPV1是检测辣椒中引发灼烧感的物资的受体，并与其它痛感蛋白紧密相干。加利福利亚大学病理学家DavidJulius等人之前尝试结晶TRPV1，结果失败。用低温电子显微镜解析TRPV1项目，1开始进展缓慢。但2013年底，技术进步使得这1项目有了重大突破，他们取得了分辨率为0.34纳米的TRPV1蛋白的结构。该成果的发表对领域来讲，无异于惊雷。由于这证实了低温电子显微镜能够解析小的、重要的份子。 当我看到TRPV1的结构时，我激动得1晚上睡不着觉。 Rubinstein说道。

研究者们可能面临更多这样无眠的夜晚。Agard表示，会有更多膜蛋白相继被解析出来。

上个月由Scheres和清华大学的结构生物学家施1公合作发表的1篇文章就成功解析了1个膜蛋白。他们建立了 -分泌酶的模型， -分泌酶负责合成与阿兹海默症相干的 -淀粉斑。0.34纳米分辨率的图谱显示，比较少见的遗传性阿尔茨海默病的 -分泌酶突变后会在图谱上显现两个 热门 ，并且这类突变终会合成有毒性的 -淀粉斑。 -分泌酶的结构图帮助研究者发现为何以往的抑制剂会无效，从而增进新药的研发。程亦凡表示预期实现年产值50亿元， -分泌酶的结构非常惊人。

类似的成功吸引了制药公司的注意。他们希望借助低温电子显微镜去解析那些没法结晶的蛋白，从而更好地研发药物。Scheres如今和辉瑞公司合作，攻克离子通道。离子通道包括很多膜蛋白，例如痛感受份子和神经递质受体。 我几近被每个人联系过。 Nogales这样说道。

虽然低温电子显微镜发展迅速，很多研究者认为，它仍有巨大提升空间。他们希望能制造出更灵敏的电子探测器，和更好地制备蛋白样本的方法。这样的话，就可以够对更小的、更动态的份子进行成像，并且分辨率更高。5月，有研究者发表了1篇细菌蛋白的结构，分辨率到达了0.22纳米。这也显示了低温显微镜的潜力。

与任何热门领域1样，低温电子显微镜的发展也有烦恼。1些专家担心研究者们盲目寻求该仪器会引发1些问题。2013年HIV表面蛋白的结构图遭到了科学家们的质疑，他们认为用于建模的图片很多都是白噪声。尔后，其他团队得到的X射线晶体衍射和低温电子显微镜模型也对原模型提出了质疑。但这些研究者们坚持相信自己的结果。今年6月，在高登研究会议上，研究者们希望低温电子显微镜的结构图要有严格的质量控制。并且杂志要求作者们提供详细的建模方法。

本钱问题可能会限制低温电子显微镜的推行。Scheres估计，LMB每天用于支持低温电子显微镜的经费就到达近3万人民币，外加近1万的电费 这是由于存储和处理图片的电脑耗电量很大。Scheres表示，每天最少要花费近4万人民币，对很多地方来讲，这个费用太高。为了推行低温电子显微镜，很多基金会建立了对外公然的装备，各地研究者们可以预约使用。霍华德 休斯医学研究所在珍利亚农场研究园区配备了1台。这台装备对所有HHMI资金的研究者公然。在英国，政府和维康信托在牛津大学附近建立了低温电镜公然使用平台。参与该平台搭建的伦敦大学的结构生物学家HelenSaibil表示，有很多人想学习使用低温电镜。

洛克菲勒大学的生物物理学家RodMacKinnon就是这些人之1。他在2003年因解析1些离子通道的结晶结构而取得诺贝尔奖。MacKinnon现在对低温电镜非常着迷。 我现在处于学习曲线的斜坡阶段，非常热切。 MacKinnon这样说道。他打算用低温电镜来研究离子通道是如何开和关的。

1997年时，Henderson非常坚定地宣称，低温电镜会成为解析蛋白结构的主流工具。在将近20年后的今天，他的预测比当年有了更多底气。Henderson表示，如果低温电镜保持这样的势头继续发展，技术问题也得以解决，那末低温电镜不但会成为解析蛋白结构的选择，而是主流选择。这个目标已离我们不远了。